A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das técnicas mais empregadas na biologia molecular moderna, permitindo a detecção e quantificação de ácidos nucleicos com alta sensibilidade e especificidade. No contexto da PCR quantitativa em tempo real (qPCR), a escolha da sonda é um dos aspectos mais críticos para garantir resultados precisos e reprodutíveis.
Diversas sondas estão disponíveis comercialmente, cada uma com princípios de detecção específicos e aplicações ideais. A seguir, conheça em mais detalhes os tipos de sonda e qual se aplica melhor ao seu experimento. Confira!
Sondas fluorescentes
As sondas utilizadas em qPCR são oligonucleotídeos modificados quimicamente com fluoróforos e quencheres. Durante a amplificação, a interação entre esses elementos leva à geração de sinais fluorescentes proporcionais à quantidade de DNA amplificado. A especificidade da sonda é essencial para evitar sinais falsos positivos e garantir a detecção precisa de sequências-alvo.
TaqMan Probe
A sonda TaqMan é composta por um oligonucleotídeo com um fluoróforo na extremidade 5′ e um quencher na extremidade 3′. Durante a extensão da fita molde, a atividade 5′ → 3′ exonuclease da Taq polimerase degrada a sonda hibridizada, separando o fluoróforo do quencher e liberando sinal fluorescente. Essa sonda é altamente específica e amplamente utilizada em aplicações diagnósticas e de quantificação genômica.
Two-hybridization Probe (sondas FRET)
Utilizam duas sondas marcadas com fluoróforos diferentes que se ligam proximamente na sequência-alvo. A proximidade permite transferência de energia por ressonância (FRET) entre os fluoróforos, gerando sinal fluorescente. Essa abordagem melhora a especificidade e é indicada para análises sensíveis de mutações pontuais e detecção de SNPs.
Molecular Beacon
As sondas “beacon” formam uma estrutura em “grampo” com fluoróforo e quencher em extremidades opostas. Na ausência da sequência-alvo, a estrutura mantém o fluoróforo próximo ao quencher, suprimindo a fluorescência. Quando hibridizadas ao DNA-alvo, a estrutura se abre, separando os grupos e emitindo sinal. É ideal para aplicações que exigem alta especificidade, como detecção de mutações raras.
MGB Probe (Minor Groove Binder)
Sondas MGB contêm um ligante de sulco menor que aumenta a afinidade da sonda pela sequência-alvo e permite o uso de oligonucleotídeos mais curtos, com maior especificidade. São particularmente úteis em ensaios multiplex e para detecção de pequenas diferenças genéticas.
Scorpion Probe
Sondas em formato de escorpião integram os elementos de detecção em uma única molécula, com primer e sonda conectados por um linker. Após a extensão, a sonda se liga intramolecularmente à sequência-alvo e emite fluorescência. Apresenta alta sensibilidade e velocidade, ideal para testes clínicos rápidos.
Dual Quenching Probe
As sondas de duplo quenching incorporam dois quencheres: um próximo ao fluoróforo e outro na extremidade oposta. Essa configuração reduz significativamente a fluorescência de fundo, aumentando a sensibilidade do ensaio. São ideais para aplicações em que a precisão da detecção é essencial, como em análises clínicas ou ambientais, em que pequenas quantidades de alvo precisam ser identificadas com exatidão.
LNA Probe (Locked Nucleic Acid)
As sondas LNA utilizam nucleotídeos modificados quimicamente que aumentam a afinidade de ligação à sequência-alvo. Isso permite a detecção de alvos curtos ou com alta homologia, como microRNAs ou mutações específicas. Devido à sua alta estabilidade térmica e especificidade, as LNA probes são especialmente indicadas para aplicações desafiadoras, como análise de expressão gênica em amostras complexas ou com baixa abundância de RNA.
Como escolher a melhor sonda para qPCR?
A escolha da sonda ideal para qPCR envolve uma análise cuidadosa de diferentes aspectos técnicos e experimentais. Primeiramente, é fundamental avaliar a complexidade da sequência-alvo e o grau de especificidade necessário para o experimento. Para estudos envolvendo mutações pontuais ou SNPs, sondas com alta resolução, como MGB, molecular beacon ou LNA, são mais indicadas. Já para aplicações mais amplas, como expressão gênica relativa, as sondas TaqMan, Dual Quenching ou Scorpion podem oferecer maior robustez e sensibilidade.
Outro fator a ser considerado é o tipo de aplicação. Estudos diagnósticos exigem máxima confiabilidade e podem demandar sondas validadas clinicamente, enquanto pesquisas exploratórias permitem maior flexibilidade. A necessidade de multiplexação — detecção simultânea de múltiplos alvos em uma mesma reação — também influencia a escolha, favorecendo sondas com baixo risco de interferência cruzada e alta precisão de leitura.
Por fim, é importante ponderar o custo-benefício, especialmente em estudos de grande escala. Sondas customizadas ou pré-validadas com bom desempenho podem representar economia de tempo e recursos ao longo do projeto, oferecendo melhor desempenho experimental e resultados mais consistentes.
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Artika IM, Dewi YP, Nainggolan IM, Siregar JE, Antonjaya U. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes (Basel). 2022 Dec 16;13(12):2387. doi: 10.3390/genes13122387
