A capacidade de editar sistemas biológicos eorganismos possui um enorme potencial para aplicações em ciências básicas,medicina e biotecnologia. Endonucleases específicas de sequência programável que facilitam a edição precisa de loci genômicos endógenos agorapermitem a interrogação sistemática de elementos genéticos e variações genéticas causais1,2 em uma ampla gama de espécies. Mas o que é o CRISPR e qual a sua origem?
Para descobrir e entender mais sobre ofuncionamento interno da vida, pesquisadores precisam modificar os genes nas células. Isso costumava ser um trabalho demorado, difícil e às vezes impossível. Usando a tecnologia CRISPR/Cas9, agora é possível alterar o código da vida ao longo de algumas semanas.
Durante os estudos de Emmanuelle Charpentier sobre o Streptococcus pyogenes, um patógeno bacteriano associado a várias doenças em humanos, ela descobriu uma molécula até então desconhecida, o tracrRNA. Seu trabalho mostrou que o tracrRNA faz parte do antigo sistema imunológico da bactéria, CRISPR/Cas, que “desarma” os vírus por meio daclivagem de seu DNA.
Charpentier publicou sua descoberta em 20113 e no mesmo ano, ela iniciou uma colaboração com Jennifer Doudna, uma bioquímica com vasto conhecimento de RNA. Juntas, elas conseguiram recriar a “tesoura”genética da bactéria e simplificar os componentes moleculares para que fossemmais fáceis de usar.
Em sua forma natural, as “tesouras” genéticas reconhecem o DNA dos vírus, mas Charpentier e Doudna provaram que é possível controlar e reprogramar para que qualquer molécula de DNA em um local predeterminado possa ser cortada. Onde o DNA é cortado, é fácil reescrever o código da vida.
Desde que Charpentier e Doudna descobriram o CRISPR/Cas9em 20124, seu uso explodiu. Essa ferramenta contribuiu para muitas descobertas importantes na pesquisa básica, medicina e biotecnologia. Essas “tesouras”genéticas trouxeram as ciências da vida para uma nova era e, de muitas maneiras, estão trazendo os maiores benefícios para a humanidade. Toda essa descoberta e avanço garantiu às pesquisadoras o Prêmio Nobel de Química em 2020.
CRISPR-Cas [Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – associated protein (Cas)] são sistemas de imunidade adaptativa que estão presentes em muitas arqueias e bactérias. Esses sistemas de defesa são codificados por operons que têm uma arquitetura muito diversa e uma alta taxa de evolução tanto para os genes cas quanto para o conteúdo espaçador exclusivo. Matrizes de repetições curtas intercaladas com espaçadores únicos foram reconhecidas em genomas bacterianos e arqueanos por anos e, embora tenha sido proposto que essas matrizes de repetição poderiam ter uma função comum importante5, a natureza dessa função foi elucidada apenas recentemente.
Pesquisadores adaptaram o sistema CRISPR/Cas9 para ser usado como uma ferramenta poderosa para a modificação genética e, embora tenha sido desenvolvido apenas em 2012, CRISPR/Cas9 já se tornou uma ferramenta popular para a edição de genomas, devido à sua simplicidade, versatilidade e especificidade, quando comparado à outras técnicas utilizadas para a modificação de genomas.
A tecnologia CRISPR/Cas9 é uma técnica poderosa que revolucionou o campo da edição de genes específicos de sequência e consisteem dois componentes principais: a nuclease Cas9 e o RNA guia específico da sequência (gRNA). Eles podem formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP) muito estável. Uma vez que uma região de DNA específica é correspondida pelo gRNA que carrega Cas9, o DNA alvo é clivado com uma quebra de fita dupla. O complexo Cas9 RNP pode ser introduzido nas células diretamente e agir imediatamente após entrar na célula sem transcrição e tradução. Ao combinar a sequência de gRNA com diferentes domínios funcionais, o sistema CRISPR/Cas9 e suas variantes foram usados para uma ampla gama de aplicações de edição de genes como: knock-out, knock-in, gene up/down, purificação e visualização do genoma etc.
Figura 1: Engenharia de genoma usando osistema CRISPR-Cas9. O RNA guia (gRNA) reconhece regiões específicas no RNA hospedeiro, e complexos com Cas9, que reconhece o motivo adjacente do protoespaçador (PAM) no alvo, exerce sua função de endonuclease para causar quebras de fita dupla (DSBs). Isso aciona dois mecanismos de reparo: um é a junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que introduz mutações no local DSB; o outro mecanismo é o reparo dirigido por homologia (HDR), que permite que a informação do DNA do doador seja inserida no local da quebra.
Fonte: https://www.genscript.com/location.php?ref=gsfiles/techfiles/GenScript_CRISPR_Brochure.pdf)
Produtos de edição de genoma CRISPR/Cas9
A FastBio, em parceria com a GenScript, oferece vários kits para montar seus próprios construtos Cas9 e gRNA, bem como enzimas Cas9 purificadas para uso in vitro e in vivo.
